6月29日，普諾賽就 RAW 264.7、SF9、NK-92這三個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了一場(chǎng)直播分享，分別詳細(xì)講解了三株細(xì)胞的培養(yǎng)方法及需要注意的問(wèn)題。直播回放可以點(diǎn)擊普諾賽公眾號(hào)菜單欄【資料中心】-【往期直播回放】查看學(xué)習(xí)。本期直播答疑，從直播間的提問(wèn)中，篩選出其中有代表性的問(wèn)題，逐一進(jìn)行解答。

01

RAW 264.7細(xì)胞傳代方法：

①　培養(yǎng)基中的漂浮的細(xì)胞離心收集

②　輕拍培養(yǎng)瓶，將貼壁松散的細(xì)胞拍起來(lái)

③　用1ml的槍把貼壁的細(xì)胞吹下來(lái)

④　將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管

⑤　1200rpm 離心3min

⑥　去上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞

⑦　加入培養(yǎng)皿中（建議用培養(yǎng)皿，方便吹打）

需要觀察下細(xì)胞的增殖速度，細(xì)胞是否是聚團(tuán)漂浮，如果細(xì)胞增殖且聚團(tuán)漂浮的話，證明細(xì)胞活力是可以的?？梢試L試將漂浮細(xì)胞收集，吹散成單顆，測(cè)細(xì)胞的數(shù)量和活力，培養(yǎng)傳代時(shí)活細(xì)胞密度保持在1-1.5*10⁵/mL，多傳幾次，細(xì)胞就會(huì)貼壁展開(kāi)了。

03

文章中有關(guān)RAW264.7細(xì)胞在進(jìn)行M2 型誘導(dǎo)時(shí)有的加 IL-4（20 ng/ml）或者 IL4+IL13 誘導(dǎo)、仿生層狀殼聚糖支架（LCS），WB/QPCR 檢測(cè)。主要是看相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（MR(CD206),ArgI 高表達(dá)），極化時(shí)間需要參考文獻(xiàn)，最好是做下預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索下濃度和時(shí)間。

04

細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)以圓形為主，存在梭形狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞依舊處于分化程度較低的狀態(tài)；細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，多觸角狀態(tài)時(shí)分化程度較高，貼壁牢固，強(qiáng)行吹打或細(xì)胞刮取不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)一步分化，傳代時(shí)可選擇只收集能夠輕輕吹打下來(lái)的圓形細(xì)胞，這部分細(xì)胞分化程度最-低，狀態(tài)最佳，同時(shí)更換新的培養(yǎng)容器，可以每天將圓形細(xì)胞輕輕吹下來(lái)。

05

細(xì)胞倍增時(shí)間是12-30h，本身生長(zhǎng)速度快，若是不想頻繁傳代，可以嘗試擴(kuò)大細(xì)胞的傳代比例，降低培養(yǎng)基中的血清含量。

06

細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)聚集的細(xì)胞團(tuán)會(huì)逐漸增大，正常的細(xì)胞團(tuán)顯微鏡下為白色透亮的細(xì)胞團(tuán)，若細(xì)胞聚團(tuán)比較多，100倍鏡下有6-8個(gè)大的細(xì)胞團(tuán)可傳代。

傳代方法：將培養(yǎng)瓶輕輕晃幾下，或者用移液器輕輕吹散（一般吹2-3次即可），吹打力度不可過(guò)大，不要全部吹散，否則會(huì)出現(xiàn)大量死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。均分到兩個(gè)瓶子里，每瓶再補(bǔ)充等量培養(yǎng)基；

細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求也很高，不能團(tuán)塊過(guò)大大導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不足。

07

細(xì)胞團(tuán)過(guò)大時(shí)，鏡下觀察團(tuán)中部會(huì)發(fā)暗，中間的細(xì)胞會(huì)接觸不到營(yíng)養(yǎng)，可以用槍頭輕輕吹1-2下，吹打力度不能太大，將團(tuán)吹小，不要全部吹散。

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NK-92細(xì)胞平常培養(yǎng)時(shí)是會(huì)有細(xì)胞碎片的，若是有大量碎片，可以一周低速離心一次（800rpm，3min），去除部分死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。

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NK-92細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中死細(xì)胞和細(xì)胞碎片都懸浮在培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)程中不會(huì)完-全沒(méi)有死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，且細(xì)胞聚團(tuán)懸浮，平常將細(xì)胞吹散成單顆測(cè)活力時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致部分細(xì)胞損傷，所以活率在80-90%是正常的范圍。

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馴化前細(xì)胞活率要比較高，能夠達(dá)到90%以上，馴化過(guò)程需要把握好細(xì)胞的密度，避免接種密度過(guò)低，導(dǎo)致生長(zhǎng)速度慢，若是有碎片可以采用800轉(zhuǎn)離心去除。

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可以采用Cellfectin® II 試劑，是一種陽(yáng)離子脂質(zhì)制劑，設(shè)計(jì)用于昆蟲(chóng)細(xì)胞的極-佳轉(zhuǎn)染；PEI MAX也可用于轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)可篩選出合適轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，有利于轉(zhuǎn)染效率。

一般會(huì)加一個(gè)GFP的對(duì)照質(zhì)粒，3-4天后可觀察是否有熒光反應(yīng)，昆蟲(chóng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后約5-7天后，大部分細(xì)胞變大病變，出現(xiàn)裂解的現(xiàn)象。

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首先要確認(rèn)下黑點(diǎn)是什么污染，如果是細(xì)菌污染，污染物（黑點(diǎn)）較少，細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)速度未收到影響時(shí)可以嘗試5%雙抗洗滌2遍，培養(yǎng)基中加大雙抗比例，去除污染；如果不是細(xì)菌污染，加雙抗是沒(méi)有效果的，需要注意消化時(shí)間的把握，傳代過(guò)程盡量少吹打。

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支原體污染的細(xì)胞一般表現(xiàn)為細(xì)胞背景臟，背景有大量細(xì)胞碎片，細(xì)胞生長(zhǎng)速度也可能受到影響，具體是否是支原體污染需要進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，單憑顯微鏡觀察并不能確定是支原體污染。